PEMBUATAN SEL KOMPETEN DAN TRANSFORMASI

Pendahuluan

Tahap berikutnya dalam eksperimen pengklonan gen setelah molekul DNA rekombinan berhasil dikonstruksi adalah memasukkan molekul DNA rekombinan tersebut ke dalam sel hidup yang disebut sel inang. Sel inang yang paling umum digunakan adalah Escherichia coli. Tidak semua sel secara alami memiliki kemampuan untuk menyerap DNA asing. Setiap sel memiliki efisiensi yang berbeda dalam menyerap molekul DNA. Beberapa spesies yang dapat menyerap DNA secara efisien adalah Bacillus dan Streptococcus. Sel yang tergolong tidak efisien dalam menyerap DNA adalah Escherichia coli. Sel ini memiliki kemampuan alami menyerap DNA asing yang rendah (Tsen et al. 2002). Kemampuan sel dalam menyerap DNA dapat ditingkatkan dengan perlakuan khusus, sehingga sel tersebut menjadi kompeten. Sel kompeten adalah sel yang dapat menyerap DNA karena telah mendapat perlakuan fisik maupun kimia. Sel dapat dibuat kompeten melalui perlakuan dengan garam kalsium klorida (CaCl₂) atau rubidium klorida (RbCl).

Pemasukkan molekul DNA rekombinan ke dalam sel inang disebut transformasi apabila vektor yang digunakan berupa plasmid. Peristiwa ini disebut transformasi karena plasmid dapat mengubah sifat sel inang. Keberhasilan plasmid masuk dan bertahan di dalam sel umumnya dideteksi berdasarkan ekspresi gen marka yang dibawa oleh plasmid tersebut.

Proses transformasi merupakan proses yang tidak efisien walaupun sel telah dibuat kompeten. Bagian sel yang berhasil menyerap DNA plasmid sangat rendah, sehingga diperlukan metode untuk membedakan antara sel transforman dan sel nontransforman. Sel transforman adalah sel yang berhasil menyerap DNA plasmid, sedangkan sel nontransforman adalah sel yang tidak membawa DNA plasmid. Seleksi transforman umumnya berdasarkan adanya marka seleksi yang disisipkan pada plasmid. Marka seleksi merupakan gen yang memberi karakterisrik baru pada sel transforman yang tidak dimiliki oleh sel bukan transforman.

Sel inang yang telah mengandung DNA rekombinan dibiakkan dalam medium padat, sehingga membentuk koloni. Koloni yang terbentuk merupakan sekumpulan sel yang identik karena hasil pembiakan sebuah sel. Koloni yang dapat tumbuh pada media seleksi ini adalah koloni yang berasal dari bakteri transforman saja.

Tujuan Praktikum

Praktikum ini bertujuan membuat sel Escherichia coli kompeten, melakukan transformasi sel E. coli dengan DNA plasmid , dan melakukan seleksi transforman.

Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan pada praktikum ini adalah mikrosentrifus, tabung Eppendorf, tabung 10 mL, tip, pipet mikro, labu Erlenmeyer, neraca, sudip, cawan Petri, laminar, bunsen, korek api, segitiga penyebar, autoklaf, kapas, aluminium foil, dan penangas air.

Bahan-bahan yang digunakan pada praktikum ini adalah larutan MgCl₂ 100 mM, larutan CaCl₂ 75 mM, ekstrak ragi, tripton, NaCl, ampisilin, alkohol, akuades, agar, es, bakteri Escherichia coli, dan DNA plasmid.

Prosedur Percobaan

Pembuatan sel kompeten dilakukan dengan cara sebanyak 1 mL kultur bakteri yang telah dibiakkan semalam dalam medium Luria Bertani (LB) dipindahkan ke dalam 10 mL LB, kemudian diinkubasi pada suhu 37^oC selama 4 jam. Sebanyak 10 mL kultur disentrifugasi pada kecepatan 8000 rpm dan suhu 4^oC selama 2 menit. Supernatan hasil sentrifugasi dibuang, sedangkan pelet disuspensikan dalam 5 mL MgCl₂ 100 mM. Tabung didiamkan di dalam es selama 30 menit, kemudian disentrifugasi kembali pada kecepatan 8000 rpm. Supernatan hasil sentrifugasi dibuang, sedangkan pelet disuspensikan dalam 1 mL CaCl2 75 mM. Sebanyak 100 µl sel kompeten digunakan untuk percobaan transformasi.

Transformasi sel bakteri dilakukan dengan cara sebanyak 100 µl sel kompeten dipindahkan ke dalam tabung Eppendorf, kemudian ditambahkan 2 µl DNA plasmid. Tabung Eppendorf didiamkan di dalam es selama 30 menit. Tabung diberikan kejut panas pada suhu 42^oC selama 45 detik. Sebanyak 400 µl medium LB ditambahkan ke dalam tabung dalam Eppendorf dan diinkubasi selama 30 menit. Sebanyak 100 µl produk transformasi dituang dan ditaburkan dalam medium LB dan diinkubasi pada suhu 37^oC semalam (18 jam).

Hasil Pengamatan

Gambar 1 Kontrol negatif.

Gambar 2 Hasil seleksi transforman Escherichia coli.

Pembahasan

Untuk pembuatan sel kompeten, digunakan kultur E.coli yang berusia 4 jam. Kultur berusia 4 jam ini diperkirakan telah mengalami fase log. Fase log diperlukan agar jumlah bakteri yang terisolasi untuk pembuatan sel kompeten optimal. Kemudian untuk memisahkan bakteri dengan medium pertumbuhannya dilakukan sentrifugasi 8000 rpm suhu 4^oC selama 2 menit.

Bakteri yang terdapat pada bagian pelet kemudian diresuspensi kembali dengan larutan MgCl₂. Berdasarkan Zhang et al. (2007) yang melakukan pengujian pengaruh Mg²⁺ terhadap membran lipid bilayer buatan, ditemukan bahwa Mg²⁺ menurunkan kerapatan membran. Hal ini dikarenakan interaksi antara mineral tersebut dengan bagian hidrofilik dari membran. Melalui hasil ini dapat diketahui bahwa penambahan MgCl₂ berperan dalam mengganggu kestabilan membran sel E.coli.

Fungsi penambahan CaCl₂ pada pembuatan sel kompeten belum diketahui secara jelas. Penambahan etanol pada pembuatan sel kompeten menurunkan efisiensi transformasi. Hal ini dikarenakan adanya leaching terhadap lipopolisakarida dari dinding sel. Hasil ini menguatkan dugaan bahwa adsorpsi DNA didukung oleh LPS dinding sel bakteri. Mekanisme yang diajukan adalah pengikatan DNA pada molekul LPS sel kompeten dilanjutkan dengan pemasukan DNA ke sitosol karena adanya disintegrasi membran sel akibat CaCl₂ (Sarkar et al. 2002). Menurut Primrose & Twyman (2006), CaCl₂ mempengaruhi dinding sel dan mungkin berperan dalam pengikatan DNA pada permukaan sel. Literatur yang sama menyebutkan bahwa penyerapan DNA secara nyata sebenarnya dipengaruhi oleh perlakuan kejut panas.

Kultur sel E.coli yang telah mengalami perlakuan MgCl₂ dan CaCl₂ dalam percobaan ini menjadi sel yang kompeten. Fragmen DNA asing yang ditransformasikan adalah plasmid. Plasmid ini mengandung gen yang ingin diinsersikan dan gen yang menyandikan sifat resistensi terhadap ampisilin yang berperan sebagai marka seleksi (Gambar 3).

Sel E.coli yang kompeten diberi perlakuan kejut panas untuk membuka pori pada dinding sel bakteri. Inkubasi dengan plasmid akan menyebabkan masuknya plasmid ke dalam sel. Penambahan media LB setelah perlakuan kejut panas berfungsi untuk memenuhi kebutuhan nutrisi dari bakteri setelah mengalami perlakuan yang ekstrem.

Untuk mengetahui sel yang telah mengalami transformasi maka dilakukan seleksi transforman dengan memanfaatkan sifat yang dibawa sebagai marka seleksi. Bakteri ditumbuhkan pada medium yang mengandung ampisilin. Dengan adanya ampisilin, maka sel E. coli yang dapat tumbuh hanya sel transforman atau sel yang telah memasukkan plasmid. Inkubasi selama 18 jam akan menumbuhkan koloni bakteri yang berasal dari sel tunggal. Semua bakteri yang tumbuh dalam koloni tersebut akan memiliki sifat yang sama sebagai bakteri transforman.

Gambar 3 Plasmid dengan marka seleksi gen resistensi ampisilin.

Hasil yang didapatkan dari pengamatan adalah terjadi pertumbuhan bakteri baik pada kontrol negatif maupun sampel (Gambar 2 & 3). Secara teori, bakteri yang ditumbuhkan pada cawan kontrol negatif adalah bakteri yang bukan transforman sehingga tidak boleh ada pertumbuhan. Adanya koloni bakteri yang dapat tumbuh menandakan terjadinya kontaminasi bakteri transforman pada cawan kontrol negatif. Sementara pada cawan sampel terjadi pertumbuhan bakteri E.coli transforman yang telah membentuk koloni tunggal. Transformasi antara sel yang kompeten dapat terjadi saat bakteri ditumbuhkan dalam media dan dapat menyebabkan kesalahan pada perhitungan laju transformasi. Hal ini dapat diperbaiki dengan penambahan EDTA pada media seleksi (Williams et al. 1996).

Sel E. coli secara alami memiliki kemampuan transformasi yang rendah. Peningkatan kemampuan transformasi secara alami dilakukan dengan memanen sel pada fase stasioner dan penumbuhan kembali pada media. Sel yang kompeten diperoleh pada fase lag dan menghilang pada fase log (eksponensial). Laju transformasi meningkat seiring dengan jumlah plasmid hingga mencapai fase plateau (Tsen et al. 2002).

Peningkatan efisiensi transformasi dapat dilakukan dengan modifikasi metode standar CaCl₂. Konsentrasi optimum CaCl₂ adalah 75 mM. Sel kompeten yang disimpan dalan -20^oC dapat bertahan hingga 7 hari, sementara penyimpanan pada -70^oC dapat bertahan hingga 15 hari. Media LB diganti dengan media SOC yang berisi tripton, ekstrak ragi, NaCl, MgCl₂, MgSO₄, dan glukosa. Media ini mendukung pertumbuhan transforman yang lebih cepat. Sementara itu, pada saat transformasi dengan plasmid ditambahkan DMSO dan PEG₈₀₀₀. Penambahan ini mampu meningkatkan efisiensi transformasi antara 100-300 kali lipat (Tu et al. 2005).

Simpulan

Sel E. coli kompeten dapat dibuat dengan perlakuan MgCl₂ CaCl₂, dan kejut panas. Sel kompeten mampu melakukan transformasi dengan plasmid yang mengandung resistensi terhadap amipisilin. Pertumbuhan koloni tunggal pada media seleksi menunjukkan adanya bakteri transforman. Terjadi kontaminasi bakteri transforman pada cawan kontrol negatif.

Daftar Pustaka

Primrose SB, Twyman RM. 2006. Principles of Gene Manipulation and Genomics. Ed. Ke-7. Oxford: Blackwell Publishing.

Sarkar S, Chaudhuri S, Basu T. 2002. Mechanism of arttificial transformation of E.coli with plasmid DNA-clues from the influence of ethanol. Current Science 83:1376-1380.

Tsen et al. 2002. Natural plasmid transformation in Escherichia coli. Journal of Biomedical Science 9:246-252.

Tu et al. 2005. An improved system for competent cell preparation and high efficency plasmid transformation using different Escherichia coli strains. Electronic Journal of Biotechnology 8.

Williams HG, Day MJ, Fry JC. 1996. Use of EDTA to prevent spontaneous cell-to-cell transformation provides a more accurate estimation of gene transfer frequencies. Biology Techniques 10:941-946.

Zhang et al. 2007. Effects of Mg2+ on supported bilayer membrane on a glassy carbon electrode during membrane formation. International Journal of Electrochemical Science 2:788-796.